- 品名： 貝博生物 細(xì)胞外酸化檢測試劑盒BB-48311
- 型號： BB-48311
- 產(chǎn)品詳情
- 規(guī)格參數(shù)
產(chǎn)品概述 product description
貝博? BBcellProbe? 細(xì)胞外酸化率（ECAR）檢測試劑盒（Extracellular acidification Rate Assay Kit）是利用貝博? 合成的酸化檢測熒光探針BBcellProbe? P61來檢測細(xì)胞外酸化情況變化的試劑盒?？梢酝ㄟ^簡單的混合基于熒光酶標(biāo)儀便捷的直接進(jìn)行細(xì)胞外酸化情況的動態(tài)實時測定。 細(xì)胞外酸化（Extracellular Acidification ；ECA）測量可以為糖酵解（glycolytic）活性研究提供豐富的信息，本試劑盒可用于代謝表征并確定具體的干預(yù)措施（如養(yǎng)分缺失、缺氧、藥物治療或遺傳基因操控）如何影響糖酵解通量。 細(xì)胞代謝與癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、肥胖、糖尿病及干細(xì)胞等多個領(lǐng)域息息相關(guān)。糖酵解是真核細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝途徑，在分化、增殖和 ATP 生成等生理過程中起重要作用。糖酵解的改變對多種疾病也具有重要意義，包括但不限于癌癥、心血管疾病和代謝疾病。 能量代謝指標(biāo)胞外酸化率（ECAR）可幫助研究人員更多地了解細(xì)胞對外界的應(yīng)激反應(yīng)和運作機制。但以往細(xì)胞代謝的檢測技術(shù)存在較多限制，例如難以對細(xì)胞代謝進(jìn)行連續(xù)、實時的檢測；一些專門檢測細(xì)胞代謝的儀器、硬件貴，試劑耗材消耗成本高，實驗重復(fù)性低且只能檢測有限指標(biāo)。 與傳統(tǒng)的終點糖酵解分析不同， 使用BBcellProbe? P61糖酵解分析可以實時測定細(xì)胞外酸化率 (ECAR)，可以觀察糖酵解機制的短暫變化和快速反應(yīng)。樣品不需要密封處理，在這些條件下， ECAR 是一種可靠且穩(wěn)定的糖酵解活性測定方法。 BBcellProbe? P61細(xì)胞外酸化分析可以實時測量細(xì)胞糖酵解活性，是以高通量形式來評估用于代謝表征的細(xì)胞呼吸以及評估治療對細(xì)胞功能毒性作用的一種可靠方法。 它可以使用熒光酶標(biāo)儀在標(biāo)準(zhǔn)微孔板上進(jìn)行簡單動力學(xué)測定。隨著糖酵解作用的進(jìn)行，丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，這將導(dǎo)致細(xì)胞外環(huán)境 pH 降低。P61探針可以靈敏地檢測到 pH 降低，并表現(xiàn)為BcellProbe? P61探針熒光信號增加，從而實現(xiàn)對ECAR的測定。 BBcellProbe? P61最大激發(fā)波長為 488nm，最大發(fā)射波長為 580nm。其熒光在堿性條件下強度較弱，反之酸性條件下變強，從而BBcellProbe? P61可被用于監(jiān)測細(xì)胞外酸化的變化。在測定中，細(xì)胞外酸化率由熒光信號隨時間的變化計算。細(xì)胞外酸化增加，熒光信號的變化率增加；反之，酸化減少，熒光信號的變化率降低。 BBcellProbe? P61與乳酸的這種反應(yīng)是非破壞性且完全可逆的，BBcellProbe? P61沒有細(xì)胞毒性，其是化學(xué)穩(wěn)定的，惰性的，水溶性的和細(xì)胞不滲透的，不能透過完整的細(xì)胞膜。因此還可以同時與細(xì)胞耗氧率， 線粒體膜電位， ROS和細(xì)胞ATP 、LDH等檢測的試劑結(jié)合使用，進(jìn)行多參數(shù)檢測。 用BBcellProbe? P61進(jìn)行細(xì)胞外酸化檢測方法及其簡單，不需要適用特殊的儀器設(shè)備，只需要熒光酶標(biāo)儀之類的熒光讀板設(shè)備即可。 BBcellProbe? P61采用可見光激發(fā)檢測，相對于采用紫外光激發(fā)的檢測試劑，細(xì)胞損傷更低，對細(xì)胞的毒害更小。結(jié)果更加準(zhǔn)確客觀。 貝博? BBcellProbe? 細(xì)胞酸化檢測試劑盒可以用于直接，實時分析細(xì)胞外酸化情況。本試劑盒可以用來測量各種全細(xì)胞（貼壁和懸浮細(xì)胞），各種3D培養(yǎng)物，組織，小生物，球體，支架和基質(zhì)等。 以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板計，本試劑盒小包裝可以檢測200個樣本。
保存溫度
2-8℃ 避光
注意事項
1.探針-20℃密封避光保存；
2.避免反復(fù)凍融?？梢愿鶕?jù)實驗進(jìn)度安排小量分裝保存；
3.探針P61需要配制成工作液后使用，注意看操作步驟以及注意事項；
4.檢測緩沖液為無菌試劑，注意防止污染；
5.試劑拆封后請盡快使用完！
有效期
6個月
檢測方法
熒光酶標(biāo)儀
適用樣本
細(xì)胞
產(chǎn)品特點
1.廣泛適用于各種體外模型；不再局限于單層細(xì)胞，還能測定懸浮細(xì)胞和特定的 3D 培養(yǎng)物；
2.簡單的“混合-檢測”方案允許使用多種其他分析試劑盒進(jìn)行多參數(shù)分析；
3.無損可逆轉(zhuǎn)，能夠觀察細(xì)胞外酸化的瞬態(tài)和長時間變化；
4.可適配多數(shù)熒光酶標(biāo)儀以及標(biāo)準(zhǔn) 96 孔和 384 孔；
5.以高通量的形式方便地測量； 6.無需等待專用設(shè)備空閑所需的實驗室時間，也無需大額資金專用設(shè)備投入
產(chǎn)品應(yīng)用
細(xì)胞代謝研究
儀器準(zhǔn)備
1.熒光酶標(biāo)儀
須配備相應(yīng)的波長過濾器和溫度控制器。
須配備溫度控制器。
2.離心機
3.pH計
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒
試劑準(zhǔn)備
1.PBS緩沖液或者HBSS ? 2.KOH / HCl
3.對照試劑（選配，非必須）：
Glucose Oxidase，2-Deoxyglucose，寡霉素A，抗霉素A，F(xiàn)CCP
耗材準(zhǔn)備
1.黑色透明底熒光專用培養(yǎng)板
2.0.22 μm針頭過濾器
3.離心管
4.吸頭
5.一次性手套
使用注意事項
1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.細(xì)胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細(xì)胞。
3.以下操作以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例。其他培養(yǎng)容器或裝置請根據(jù)實際情況調(diào)整試劑用量和檢測方法。各試劑等比例調(diào)整即可。
4.BBcellProbe? P61探針的信號變化直接取決于所測量細(xì)胞類型的細(xì)胞外酸化速率，建議盡可能使用每孔高的細(xì)胞密度作為起點，并根據(jù)需要減少細(xì)胞數(shù)量。
5.并非所有細(xì)胞類型都產(chǎn)生足夠用于檢測的酸化。
6.最好使用熒光培養(yǎng)專用的透明底黑色培養(yǎng)板。實在沒有的話可以采用透明板，注意細(xì)胞孔間隔開，減少檢測時各孔之間的光互相干擾。
7.用于測定的所有儀器試劑溶液耗材均需37℃預(yù)熱。
8.盡可能使用多通道移液器添加試劑。
9.建議每個測試樣做3復(fù)孔。
10.試劑盒所配的檢測緩沖液不能用其它緩沖液（如PBS/HBSS等）或培養(yǎng)基代替。說明書中所有提到使用檢測緩沖液B的地方必須使用試劑盒所配的檢測緩沖液。
11.待檢測樣本量較多時，可以采用簡化的試劑配制步驟：將100 μL P61探針試劑（母液）添加到9900 μL預(yù)熱的檢測緩沖液中（100倍稀釋），并使用多通道移液器，將100 μL稀釋的含P61探針的檢測緩沖液液添加到每個孔中（非空白對照孔，空白對照不含探針）。
12.ECAR/糖酵解測定通常允許同時實時測量多參數(shù)（或多重）組合，常與細(xì)胞耗氧量（OCR）同時測定（相關(guān)產(chǎn)品貨號：BB-48211），分析細(xì)胞的代謝表型以及測定糖酵解和線粒體呼吸兩種途徑之間的轉(zhuǎn)換情況。
使用方法
關(guān)于儀器設(shè)置：
? 溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀。
? 常規(guī)的熒光信號強度測量，使用基于單色儀或基于過濾器的酶標(biāo)儀，最佳激發(fā)波長使用488 nm或514 nm，發(fā)射波長使用580-590 nm?？筛鶕?jù)實際機器和樣本選擇信號最強的波長。
? 具有檢測增益參數(shù)（PMT，Parameters）的通常設(shè)置為中或高。
? 一般使用底部讀數(shù)bottom read。
關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)：
? 對于貼壁細(xì)胞，在200 μL培養(yǎng)基中的96孔板中接種細(xì)胞。在37 ℃ 的CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。
? 對于懸浮細(xì)胞，在檢測當(dāng)天在100 μL培養(yǎng)基中接種。
? 注意所需的接種密度取決于細(xì)胞類型。 我們推薦進(jìn)行細(xì)胞接種密度預(yù)實驗以確定最佳密度。通常從高細(xì)胞密度（通常為60,000-80,000個）開始，每孔的最佳細(xì)胞數(shù)一般為：貼壁細(xì)胞每孔80,000個細(xì)胞，懸浮細(xì)胞每孔5-6 x 105（96孔板）。
? 檢測待測樣品都設(shè)置3復(fù)孔。
? 注意始終在每個96孔板上留出至少6個孔，以免添加細(xì)胞作為空白對照和信號控制孔。
? 如果將細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，則去除二氧化碳非常重要，殘留的二氧化碳可能會導(dǎo)致酸化。在進(jìn)行P61酸化檢測之前先將培養(yǎng)板殘余二氧化碳進(jìn)行去除，方法是提前通過在37℃，濕度為95％的無二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞約兩個小時。
關(guān)于細(xì)胞接種密度測試：
? 對于不同的細(xì)胞，對于相同細(xì)胞的不同干預(yù)模型，最佳的細(xì)胞接種密度是不同的。有條件的話坐下細(xì)胞接種密度測試可以得到更好的實驗結(jié)果。
? （推薦細(xì)胞接種密度測試，以下可選，非必須）：
為了確定待測細(xì)胞模型的最佳接種密度，在實驗前，選擇一系列細(xì)胞接種密度，測定熒光強度與時間函數(shù)數(shù)據(jù)，然后確定正式實驗的接種密度。
關(guān)于對照孔設(shè)置：
? 一般空白孔要設(shè)置，其它對照根據(jù)實驗需要決定。
? （推薦對照設(shè)置，以下可選，非必須）：
操作步驟：
1. 探針工作液試劑配制：
用試劑B檢測緩沖液10倍稀釋探針P61（母液）（每100 μL P61探針中加入900 μL檢測緩沖液），充分混勻，配制成P61探針工作液，備用。
2. 準(zhǔn)備細(xì)胞模型。
3. 培養(yǎng)好的待檢測細(xì)胞移除培養(yǎng)基，用檢測緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。每次洗滌每孔使用100 μL檢測緩沖液。
4. 去除第二次洗滌的檢測緩沖液，加入90 μL新的檢測緩沖液。
5. 每孔加入10 μL BBcellProbe? P61酸化熒光探針，充分混勻。
6. （可選）可以在此處添加待測試化合物藥物（通常為1-10 μL）（如果需要的話）。
7. 然后用該細(xì)胞板進(jìn)行熒光細(xì)胞外酸化變化情況檢測。用熒光讀板設(shè)備讀取該細(xì)胞板的熒光數(shù)據(jù)。
激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長580 nm-590 nm。
每2分鐘或3分鐘讀取一次。測量時間大于120分鐘。
8. 繪制酸化率曲線。
9. 計算每個樣品的斜率值。
常見問題分析
1.酸化率檢測趨勢跟預(yù)期的不一致？
檢查細(xì)胞接種和移液的一致性。
增加細(xì)胞密度。
將測定體積減少到60微升。
在某些較短的檢測時間區(qū)間內(nèi)，會出現(xiàn)熒光數(shù)據(jù)的波動情況，出現(xiàn)斜率下降或不變化，需要擴大到更長的時間范圍內(nèi)來分析酸化率趨勢。一般檢測時間范圍不少于60分鐘。
溫度對檢測有較大影響。有條件的話，務(wù)必使用配有溫度控制的酶標(biāo)儀，儀器以及所有培養(yǎng)基和儲備溶液均須使用前37℃預(yù)熱。注意某些讀板器的溫度控制不一致，如果存在這種情況，請考慮將測定和平衡溫度降低到30℃。
避開培養(yǎng)板外圈。
2.使用的細(xì)胞類型靈敏度不夠？
可以考慮以下改善方案：
增加酶標(biāo)儀的增益（PMT）設(shè)置。
增加BBcellProbe? P61酸化熒光探針的體積（15μL/孔）。
增加細(xì)胞密度。
將測定體積減少到60微升。
測量底部讀數(shù)（如果有）。
調(diào)整TR-F焦距。
3.我無法在含有細(xì)胞的孔中檢測到任何信號，或者我可以檢測到信號，但斜率（速率）顯得很低？
檢查正確的儀器設(shè)置，設(shè)置信號優(yōu)化。
增加細(xì)胞密度。
將測定體積減少到60微升。
避免使用微孔板的外圈孔。
